前情回顧：Actin甲硫氨酸氧化：動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)的下一個(gè)層次

前面我們介紹了肌動(dòng)蛋白氧化的相關(guān)研究進(jìn)展，這個(gè)領(lǐng)域的研究相對(duì)來說還比較少還有許多值得探索的空間，細(xì)胞骨架研究領(lǐng)域的資深供應(yīng)商Cytoskeleton開發(fā)了幾款新品Actin，致力于給細(xì)胞骨架研究者們提供更好的產(chǎn)品，以助力他們進(jìn)行更深層次的研究，下面我們首先來了解一下相關(guān)的背景知識(shí)：

芘標(biāo)記的Actin用于肌動(dòng)蛋白聚合檢測(cè)：

肌動(dòng)蛋白聚合程度的測(cè)定是評(píng)價(jià)化合物對(duì)肌動(dòng)蛋白功能影響的一種快速有效的方法，到目前為止，最通用、最敏感、最容易使用的方法是Fluorescence enhancement of pyrene conjugates——芘共軛物的熒光增強(qiáng)法來判斷聚合程度，它包括將你的對(duì)照品和測(cè)試品與少量的芘結(jié)合的肌動(dòng)蛋白混合，然后進(jìn)行聚合，芘-肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合成聚合物形式后，熒光會(huì)增強(qiáng)到20倍（見圖2）。

圖2. 芘標(biāo)記的Actin聚合過程中的熒光增強(qiáng)。通過添加Actin聚合緩沖液（BSA02），芘標(biāo)記的肌肉肌動(dòng)蛋白在96孔板中聚合 ，1小時(shí)內(nèi)每隔30秒掃描一次熒光信號(hào)。聚合的 F-actin與未聚合的芘標(biāo)記G-actin和對(duì)照緩沖液相比熒光增強(qiáng)10倍。

肌動(dòng)蛋白聚合分為三個(gè)階段，成核期（lag phase）、生長(zhǎng)期（growth phase）和穩(wěn)定期（steady state phase），如圖2所示，聚合程度由穩(wěn)定期的熒光水平來表示。

MICAL（MIC01）是一種細(xì)胞內(nèi)的黃酮蛋白單加氧酶，從昆蟲到哺乳動(dòng)物都很保守，它在氧化還原（redox）反應(yīng)中起催化劑的作用。Terman的小組闡明了MICAL與F-actin之間存在相互作用：在使用NADPH作為輔因子情況下，MICAL可氧化肌動(dòng)蛋白上的Met44和Met47（第44位和47位的甲硫氨酸）位點(diǎn)，Cytoskeleton已經(jīng)從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)并純化了人類MICAL1蛋白，重組蛋白被N-末端6xHis標(biāo)記，由全長(zhǎng)蛋白的Redox和CH結(jié)構(gòu)域（aa：1-612）組成，驗(yàn)證研究表明，MICAL1可以氧化肌動(dòng)蛋白，從而在蛋白水解測(cè)定中將枯草桿菌蛋白酶A的剪切減少90％以上。

MsrB2（MB201）是一種蛋白質(zhì)，可以還原肌動(dòng)蛋白上第44位和47位甲硫氨酸（M44和M47），MsrB2在還原肌動(dòng)蛋白的過程中被氧化，可通過DTT還原再生，當(dāng)肌動(dòng)蛋白的M44位點(diǎn)被氧化時(shí)，其聚合能力顯著降低；相反，當(dāng)被氧化的肌動(dòng)蛋白在M44位點(diǎn)被還原時(shí)，其聚合能力會(huì)恢復(fù)，肌動(dòng)蛋白聚合試驗(yàn)可用于檢測(cè)MICAL氧化肌動(dòng)蛋白與MsrB2還原肌動(dòng)蛋白對(duì)Actin聚合的影響。

枯草桿菌素A是一種蛋白酶，已被證明能在M47和G48之間特異性地切割肌動(dòng)蛋白。當(dāng)肌動(dòng)蛋白的M47位點(diǎn)被MICAL氧化時(shí)，枯草桿菌蛋白酶A切割的效率顯著降低；反之，當(dāng)肌動(dòng)蛋白的M47位點(diǎn)被MsRB2（+DTT）還原時(shí)，枯草桿菌蛋白酶A的切割效率顯著提高。因此，枯草桿菌素A可通過評(píng)估切割與未切割的肌動(dòng)蛋白，以確定MsrB2活性及對(duì)M47和M44的還原效率。

MICAL-1對(duì)Actin聚合的影響分析：

	MICAL-1（MIC01）蛋白純度測(cè)定 :   通過在4- 20％Tris-甘氨酸凝膠中電泳分離10μg MICAL-1蛋白樣品，并用考馬斯亮藍(lán)染色, 使用Precision RedTM蛋白測(cè)定試劑進(jìn)行蛋白定量。
	MICAL-1氧化的肌動(dòng)蛋白的枯草桿菌蛋白酶A檢測(cè)：   肌動(dòng)蛋白（AKL99）對(duì)照組 NADPH（400 m M）+Actin處理組 MICAL（0.076 m M）+Actin處理組 NADPH+ MICAL +Actin處理組 然后全部用枯草桿菌蛋白酶A(不)處理15min結(jié)果： 在NADPH和MICAL共同存在的情況下， 用枯草桿菌蛋白酶A處理后，被切割的肌動(dòng)蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，NADPH或MICAL單獨(dú)存在時(shí)與陰性對(duì)照無顯著差異。
	MICAL-1對(duì)Actin聚合的影響： 用MICAL（MIC01） + NADPH處理不同濃度的天然肌動(dòng)蛋白（AKL99），然后將樣品在超速離心機(jī)中100,000 g離心1.5 h。 結(jié)果：MICAL + NADPH處理后，沉淀（pel,, 主要為actin聚合體）蛋白表達(dá)量顯著高于上清液（sup, 主要為actin單體）。 表明Actin濃度為0.1g / ml時(shí)，MICAL + NADPH能將肌動(dòng)蛋白聚合程度降低50%；濃度為0.4m g / ml時(shí)，MICAL + NADPH能將肌動(dòng)蛋白聚合程度降低約20%。
	MICAL-1對(duì)Actin聚合的影響（熒光檢測(cè)） ：   芘標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白（AP05）作為對(duì)照組 NADPH處理 MICAL（MIC01）處理 NADPH + MICAL（MIC01）處理結(jié)果：NADPH + MICAL（MIC01）共同處理，聚合曲線熒光值顯著降低.，表明NADPH + MICAL共同處理才能降低肌動(dòng)蛋白聚合程度。

MICAL氧化Actin與天然Actin對(duì)比分析： 

	MICAL氧化Actin與天然Actin的枯草桿菌蛋白酶處理對(duì)比：   將芘標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白（AP05）和MICAL氧化的芘標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（MXAP95）稀釋至0.1 mg / ml（2.3 mM）。然后用枯草桿菌蛋白酶A（不）處理15min， 結(jié)果：與天然肌動(dòng)蛋白相比，MICAL氧化的肌動(dòng)蛋白，用枯草桿菌蛋白酶A處理后，被切割的肌動(dòng)蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。
	氧化Actin與天然Actin的肌動(dòng)蛋白聚合分析對(duì)比：   不同濃度芘標(biāo)記的天然肌動(dòng)蛋白（AP05）和MICAL氧化肌動(dòng)蛋白與聚合緩沖液一起孵育。 結(jié)果： 濃度為0.05g / ml時(shí)，MICAL氧化肌動(dòng)蛋白不會(huì)聚合，而天然肌動(dòng)蛋白則能夠很好地聚合； 濃度為0.1m g / ml時(shí)，MICAL氧化肌動(dòng)蛋白可聚合至天然肌動(dòng)蛋白的約50％。 表明MICAL氧化肌動(dòng)蛋白臨界聚合濃度比未修飾形式更高。

MICAL氧化Actin的MsrB2處理分析：

	MsrB2蛋白純度測(cè)定：   通過在4-20％tris-甘氨酸凝膠中的電泳分離10μg MsrB2蛋白樣品，并用考馬斯亮藍(lán)染色。使用Precision Red TM蛋白測(cè)定試劑進(jìn)行蛋白定量。
	MsrB2處理的氧化Actin的枯草桿菌蛋白酶A分析： MICAL氧化的肌動(dòng)蛋白（MetO肌動(dòng)蛋白）（Cat＃MXA95）對(duì)照組 DTT（10 mM）處理組 MB201（0.3 m M）處理組 DTT+MB201混合處理組 結(jié)果：MsRB2（Mb201）+DTT還原的氧化型肌動(dòng)蛋白將增強(qiáng)枯草桿菌蛋白酶A切割氧化Actin，而DTT單獨(dú)作用不會(huì)影響枯草桿菌蛋白酶的切割。
	MsrB2對(duì)氧化Actin聚合的影響 ：   用MsRB2 + DTT處理不同濃度的MICAL氧化的肌動(dòng)蛋白（MetO肌動(dòng)蛋白），然后將樣品在超速離心機(jī)中100,000 g離心1.5 h。結(jié)果：MsRB2 + DTT處理后，沉淀（pel, 主要為actin聚合體）蛋白表達(dá)量顯著高于上清液（sup, 主要為actin單體），表明MsRB2 + DTT能還原氧化的Actin，從而增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白的聚合。
	MsrB2對(duì)氧化Actin聚合的影響（熒光檢測(cè)） ： MsRB2（Mb201）+DTT處理MICAL氧化的芘標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白（MXAP95）后，熒光信號(hào)會(huì)在1小時(shí)內(nèi)恢復(fù)到與天然芘標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白相當(dāng)?shù)乃剑?/span>AP05），而DTT單獨(dú)處理Actin聚合能力不會(huì)恢復(fù)。

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Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學(xué)和細(xì)胞過程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發(fā)與生產(chǎn)。公司提供藥物篩選、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾（PTM）、細(xì)胞骨架研究相關(guān)的系列試劑盒和產(chǎn)品，尤其以細(xì)胞骨架相關(guān)研究見長(zhǎng)，既能滿足于樣品較少的科學(xué)研究，也可以用于小規(guī)模篩選研究和高通量大規(guī)模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動(dòng)蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現(xiàn)有產(chǎn)品的藥物篩選服務(wù)。

作為Cytoskeleton在中國(guó)的區(qū)代理，艾美捷科技有限公司將為中國(guó)客戶提供最全面的Cytoskeleton產(chǎn)品與服務(wù)。